A série acompanha a Unidade 53, que faz parte do SMU, sistema móvel de urgência fictício inspirado no SAMU. Uma das personagens centrais é a enfermeira Manuela, vivida por Valentina Herszage, que é uma novata na unidade. Ela é filha do empresário Maurício Bastos, proprietário de uma rede de hospitais privados, que consegue uma vaga para a filha na unidade com o objetivo de fazê-la abandonar a profissão.

Outro personagem importante é Pedro, interpretado por Emilio Dantas, um cirurgião talentoso diagnosticado com transtorno bipolar que busca recomeçar e reconstruir a carreira no atendimento de emergência depois que problemas pessoais o afastam da medicina privada.

A unidade é comandada por Irene, médica e chefe da equipe, que vive preocupada com a mãe, Dona Laura, vivida por Fernanda Montenegro, que enfrenta uma grave doença degenerativa. A personagem é interpretada por Yara de Novaes. O elenco conta ainda com Heloisa Jorge, Ana Hikari, Raquel Villar, William Nascimento, Jaffar Bambirra e Emilio de Mello.

Para dar mais autenticidade às cenas de resgate, o elenco passou por uma preparação específica. Os atores aprenderam procedimentos de emergência, como massagem cardíaca e utilização de desfibriladores, e também acompanharam equipes que atuam diariamente em atendimentos nas ruas.

Além disso, Ana Hikari, que vive a personagem Duda, tirou a habilitação necessária e fez aulas ao volante antes das gravações, enquanto Jaffar Bambirra, intérprete do condutor Vandam, chegou a treinar para dirigir veículos maiores. Jaffar, inclusive, descreveu a experiência como uma imersão real no dia a dia dos socorristas

?Eu estava me sentindo um socorrista de verdade. Quando a gente saía de ambulância, eu me senti um deles, como se estivesse vivendo o dia a dia daquelas pessoas. [...] A gente veste aquele macacão e se sente super-herói. Só que são super-heróis humanos, cheios de camadas, de questões. O Vandam me trouxe essa possibilidade, eu realmente me sentia fazendo uma série de herói?, comentou em entrevista ao NaTelinha.